Stützpunktschule Biologie Experimente
Aus Gyneu
* GeneProfile (Vaterschaftsnachweis - Verwandtschaftsnachweis mittels PCR)
Es wird eine Vaterschaftsanalyse durchgeführt.
Bereitstehende DNA-Sätze von Vater, Mutter, Sohn und Tochter werden vorbereitet und dann im Thermocycler zunächst einer PCR unterworfen. Hierbei werden durch die Wahl der eingesetzten Primer bestimmte VNTR-Polymorphismen (variable number of tandem repeats) amplifiziert. Die Proben werden später parallel auf einem ethidiumbromidhaltigen Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden werden über UV-Licht sichtbar gemacht. Das Bandenmuster ermöglicht eine einwandfreie Verwandtschaftsanalyse der untersuchten Personen.
* ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent-Assay)
Immunologischer Nachweis der Antikörper gegen das Proteinantigen Glutathion-S-Transferase (GST)
Das Protein Glutathion-S-Transferase (GST) ist ein Erfolg versprechender Impfstoffkandidat gegen den Erreger der Bilharziose. Nach einer Immunisierung muss zunächst überprüft werden, ob die für den Immunschutz notwendige Antikörperproduktion im Probanden stimuliert wurde, und falls ja, wie hoch die relative Konzentration der Antikörper im Serum, der sogenannte Antikörpertiter, ist. Zur Messung der Antikörpertiter bedient man sich im Regelfall der ELISA Methode. Im hier vorliegenden Experiment möchten wir die Antikörpertiter gegen GST im Serum von sechs verschiedenen Probanden, die jeweils mit GST immunisiert wurden, bestimmen. Hierzu wird eine Patientenprobe zusammen mit einer standardisierten Serum-Verdünnungsreihe getestet.
* GeneControl (Genregulation - Nobelpreis-Experiment zur Genregulation nach Jacob-Monod)
Vergleich der Regulierbarkeit zweier E.coli-Promotoren anhand ihrer Genaktivität.
Das Lac-Operon von E.coli ist ein Beispiel für ein induzierbares System und wird sowohl positiv als auch negativ reguliert.
Im Experiment GeneControl wird die Transkriptionsstärke des E.coli-Lac-Promotors und eines anderen, unkontrollierbaren E.coli-Promotors in Abhängigkeit von unterschiedlichen Nährstoffbedingungen quantitativ bestimmt. Hierzu wurden die zu analysierenden Promotoren mit einem lacZ-Gen fusioniert.
* GeneBank (Identifizierung eines Gens in einer cDNA-Bank)
Das Gen für das Protein Glutathion-S-transferase (GST) wird in einer cDNA-Bank gesucht und identifiziert.
Aus einer zuvor angelegten cDNA-Bank (Abbildung) werden sechs Bakterienklone, die unterschiedliche Plasmide tragen, analysiert. Einer dieser Klone enthält das Gen für das Protein GST. Aus den Bakterien werden die Plasmide isoliert und einem gezielten Restriktionsverdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI unterworfen. Die entstandenen Fragmente werden gelelektrophoretisch aufgetrennt. Da die Größe des GST- Gens bekannt ist, kann mittels eines Größenstandards direkt aus dem Gel ermittelt werden, welches der untersuchten Plasmide das gesuchte GST-Gen trägt.
* ProteoPur (Chromatographische Reinigung und gelelektrophoretische Analyse eines rekombinanten Proteins)
Gewinnung und Aufreinigung von Glutathion-S-Transferase aus einem E.coli-Extrakt
Das Gen für das Zielprotein Glutathion-S-Transferase wurde mit Hilfe gentechnischer Verfahren mit einem Expressionsvektor verknüpft. Mit dem Vektor wurden E.coli-Zellen transformiert. Diese produzieren daraufhin das Protein in großen Mengen. Ziel des Praktikums ist die Gewinnung des Proteins aus einem vorliegenden Extrakt der oben beschriebenen E.coli-Zellen. Dies geschieht mittels einer Affinitätschromatographie. Parallel zu den chromatographischen Reinigungsschritten wird die zunehmende Reinheit des gewonnenen Proteingemischs durch gelelektrophoretische Auftrennung demonstriert.
* Konjugation (Horizontaler Gentransfer zwischen E.coli-Stämmen)
Es wird die Übertragung eines Antibiotika-Resistenzgens zwischen verschiedenen Bakterienstämmen gezeigt
Stamm 1: Donor
Trägt ein Resistenzgen für Tetracyclin auf dem F-Plasmid Ist sensitiv gegenüber Kanamycin Trägt das lacZ-Gen für ß-Galactosidase im Bakterienchromosom
Stamm 2: Rezipient
Ist sensitiv gegenüber Tetracyclin Trägt ein Resistenzgen für Kanamycin im Bakterienchromosom Trägt kein lacZ-Gen für ß- Galactosidase
Die Stämme werden miteinander vermischt und bebrütet. Der nach einer Übertragung des F-Plasmids (Konjugation) entstehende Stamm ist gegenüber beiden Antibiotika resistent, kann aber keine ß-Galactosidase bilden. Die Ausgangsstämme und der Konjugationsansatz werden dann auf drei Agarplatten mit verschiedenen Antibiotika ausgestrichen. Alle Platten enthalten zur visuellen Verdeutlichung zudem X-Gal, dessen Spaltung durch ß-Galactosidase einen blauen Farbstoff ergibt.
* Huntingtin Test (Gendiagnostik bei Chorea Huntington)
Es wird eine Gendiagnose auf eine Veranlagung für Chorea Huntington (HD) durchgeführt
Es werden DNA-Proben einer Familie mit zwei Kindern untersucht. Der Vater ist zwar (noch?) frei von Symptomen, hat aber einen an HD erkrankten Vater.
Es gilt nun herauszufinden...
ob der Vater selbst und die Kinder (keines, eines oder gar beide?) das mutierte Huntingtin-Gen in ihren Zellen tragen. inwieweit im Falle eines positiven Befunds die Länge der CAG-Sequenz Aussagen über den Zeitpunkt des Krankheits-Ausbruchs zulässt.
Bereitstehende DNA-Sätze von Vater, Mutter, Sohn und Tochter werden vorbereitet und dann im Thermocycler zunächst einer PCR unterworfen. Hierbei wird durch die Wahl der eingesetzten Primer ein Genabschnitt um den mutierten Bereich im Gen für das Protein Huntingtin amplifiziert. Die Proben werden später parallel auf einem ethidiumbromidhaltigen Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Banden werden über UV-Licht sichtbar gemacht. Das Bandenmuster ermöglicht eine einwandfreie Aussage über eine genetische nalyse der untersuchten Personen.
* Protein Fingerprint (Verwandtschaftsanalyse bei Wirbeltieren durch vergleichende Proteinanalyse)
Fleischproben verschiedener Wirbeltiere werden durch Hitze denaturiert und mittels einer Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Banden werden durch Coomassiefärbung sichtbar gemacht. Aus den erhaltenen Banden lassen sich Rückschlüsse bezüglich der Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten Wirbeltiere ziehen.